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【干貨分享】第四期：PCR結果分析，自動基線也別用啦

基線是指在PCR擴增反應的最初數個循環里，熒光信號變化不大，接近一條直線，即所謂的基線（如圖1）。

2022-02-21


上期干貨分享，淘氣的小編留了一手，其實調節閾值線在ABI7500上還有更快捷的方法，只要在曲線圖下方把“Auto”取消，再點擊勾選Show：Threshold就可以啦！（如下圖所示）

細心的你可能發現，除了Threshold（閾值線），還有Auto Baseline（自動基線）。在通常情況下，PCR實驗結束，閾值線和基線都是默認為“Auto”的，今天，我們就來聊一聊什么是基線？取消自動基線，如何調節基線范圍？以及，基線調節和閾值線調節是怎樣配合分析PCR結果的？
　1. 什么是基線？　

基線是指在PCR擴增反應的最初數個循環里，熒光信號變化不大，接近一條直線，即所謂的基線（如圖1）。
基線范圍的設置是同步設置的，即不管一個實驗數據里面有多少擴增曲線和通道，以及各曲線指數增長期的起始位置，以ABI7500為例，該儀器一般默認的起始和終止循環數為3~15個循環（如圖2）。
圖 1

圖 2



2. 儀器自動基線與手動基線會呈現怎樣不同的結果？

情況一：你是否也遇到過這樣擴增曲線，如圖3所示，機器自動基線設置的太寬，就會導致基線下傾的現象。

圖 3

導致這種現象的主要原因就是機器自動基線設置的太寬導致的，標本在15個循環之前就進入指數增長期，而機器自動基線固定的把指數增長期作為基線，就導致此種曲線的出現，只需手動把基線起始循環數調整為指數增長期之前即可，比如將此數據的起止循環數調整為3-8個循環數后，擴增曲線就恢復正常了，如圖4所示：

圖 4


情況二：基線不平，不僅可能存在的弱陽性曲線“被淹沒”，還導致閾值線“無從安放”，如圖5所示：

圖 5

此時，只需手動把基線的起止循環數調整到合適位置即可，比如，把圖5的起止循環數改為10-20個循環后，基線就會變平整，閾值線也不再“無從安放”，如圖6所示：

圖 6


情況三：實驗中常見的氣泡干擾實驗結果分析，如圖7所示：

圖 7

氣泡導致的折線，不僅影響閾值線調節的準確性，更會影響結果的判讀。這種情況怎么調整基線呢？很簡單，只需把基線的起始循環數設置在氣泡出現的循環數后即可。比如，圖7中的2個孔位氣泡破裂的循環數為11、14，我們將起止循環數設置為15-20后，即可恢復正常，如圖8所示：

圖 8

此時調節閾值線，會更容易判斷閾值線應該處于什么位置（可以參考上一篇干貨——調節閾值線），從而得到更準確的Ct值。



3. 如何手動調節基線？

文章開頭介紹了在ABI7500上調節手動基線的快捷方法；而根據儀器的區別，調節基線的方式也會有所區別。一般來說，調節基線的位置都會在“Analysis”→ “Analysis Settings”這樣的菜單欄選項中，取消所有的“Auto…”，輸入合適的基線范圍，再“Apply”即可。不知道多少合適？沒關系，多調試幾個基線的范圍就可以調整出既美觀又準確的基線了。


關于伯杰醫療

上海伯杰醫療科技有限公司是一家致力于感染性病原體分子診斷試劑研發和應用，深耕于多重熒光 PCR 診斷試劑和痕量病毒二代測序試劑及相關服務的國家高新技術企業。公司圍繞感染性病原體這一主線，從診斷試劑、診斷儀器、測序服務和醫檢所服務等多個面提供全套解決方案。公司秉承“勇于創新，質量為先”的方針，為醫療機構、疾控公衛、高校科研等合作伙伴提供優質產品與服務。

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