【干貨分享】第五期:數(shù)字PCR知多少
在PCR擴(kuò)增階段,數(shù)字PCR先將樣品稀釋到單分子水平,再平均分配到幾十至幾萬個(gè)單元中進(jìn)行反應(yīng)。
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在定量PCR時(shí),我們常常糾結(jié)一個(gè)問題,究竟是相對(duì)定量還是絕對(duì)定量呢?如今,你無需糾結(jié)了,因?yàn)閿?shù)字PCR(digital PCR)來了。盡管這兩種技術(shù)有些類似,都是估算起始樣品中的核酸量,但它們有一個(gè)重要的區(qū)別:定量PCR是依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線或參照基因來測(cè)定核酸量,而數(shù)字PCR則讓你能夠直接數(shù)出原始拷貝數(shù),是對(duì)起始樣品的絕對(duì)定量。
在PCR擴(kuò)增階段,數(shù)字PCR先將樣品稀釋到單分子水平,再平均分配到幾十至幾萬個(gè)單元中進(jìn)行反應(yīng)。與qPCR對(duì)每個(gè)循環(huán)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光測(cè)定的方法不同,數(shù)字PCR是在擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行采集,有熒光信號(hào)記為1,無熒光信號(hào)記為0,有熒光信號(hào)的反應(yīng)單元中至少包含一個(gè)拷貝。
數(shù)字PCR原理示意圖
由于dPCR是一種終端分析法,如果目標(biāo)分子沒有很好的離散化,如一些小室在結(jié)束時(shí)具有不止一個(gè)的靶標(biāo),那么理論上結(jié)果得到的濃度可能就會(huì)棄之不用,這就是泊松統(tǒng)計(jì)發(fā)揮作用的地方。采用泊松概率分布公式(Poisson distribution)進(jìn)行計(jì)算,根據(jù)數(shù)字PCR反應(yīng)單元總數(shù)和有熒光信號(hào)的單元數(shù)以及樣品的稀釋倍系數(shù),就可以得到樣本的最初拷貝數(shù)(濃度)。
1999年,Vogelstein和Kinzler首次提出了數(shù)字PCR概念。2006年,F(xiàn)luidigm公司推出了第一臺(tái)基于芯片的商品化數(shù)字PCR系統(tǒng),而后QuantaLife又利用油包水微滴生成技術(shù)開發(fā)了微滴式數(shù)字PCR技術(shù)。在QuantaLife公司被Bio-Rad公司收購(gòu)后,其微滴式數(shù)字PCR儀產(chǎn)品更名為QX100型號(hào)儀。2013年,該公司又推出了升級(jí)型號(hào)QX200。
利用微滴發(fā)生器可以一次生成數(shù)萬乃至數(shù)百萬個(gè)納升甚至皮升級(jí)別的單個(gè)油包水微滴,該微滴是數(shù)字PCR的樣品分散載體;PCR反應(yīng)結(jié)束后再利用檢測(cè)儀器檢測(cè)每個(gè)微滴的熒光信號(hào)。大量的微滴提供了足夠的精確度,能準(zhǔn)確測(cè)定拷貝數(shù)狀態(tài)。微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)的出現(xiàn)使得數(shù)字PCR的靈敏度上升到了新的臺(tái)階。
目前,數(shù)字PCR在液體活檢中具有廣泛的應(yīng)用,包括基因表達(dá)差異化研究、基因組學(xué)及表觀遺傳學(xué)研究等。其在低濃度和低豐度病原體中的絕對(duì)定量、無標(biāo)準(zhǔn)品病原體絕對(duì)定量中的應(yīng)用也逐漸凸顯,特別是隨著新冠疫情的發(fā)展,對(duì)于低拷貝數(shù)樣本的檢測(cè)逐漸成為了研究熱點(diǎn)與關(guān)注焦點(diǎn)。
伯杰醫(yī)療始終堅(jiān)持創(chuàng)新,致力于成為真正的“病原體診斷專家”。目前,伯杰技術(shù)服務(wù)部已推出新型冠狀病毒、流感病毒、諾如病毒等病原體數(shù)字PCR檢測(cè)服務(wù)。
該項(xiàng)服務(wù)基于伯杰醫(yī)療近期引進(jìn)的法國(guó)stilla數(shù)字PCR儀,儀器采用最新的油包水微滴生成技術(shù),靈敏度可達(dá)0.2拷貝/uL;同時(shí),該數(shù)字PCR平臺(tái)將結(jié)合伯杰先進(jìn)的測(cè)序技術(shù),更深入地在呼吸道病原體檢測(cè)領(lǐng)域譜寫新篇章!
上海伯杰醫(yī)療科技有限公司是一家致力于感染性病原體分子診斷試劑研發(fā)和應(yīng)用,深耕于多重?zé)晒?PCR 診斷試劑和痕量病毒二代測(cè)序試劑及相關(guān)服務(wù)的國(guó)家高新技術(shù)企業(yè)。公司圍繞感染性病原體這一主線,從診斷試劑、診斷儀器、測(cè)序服務(wù)和醫(yī)檢所服務(wù)等多個(gè)面提供全套解決方案。公司秉承“勇于創(chuàng)新,質(zhì)量為先”的方針,為醫(yī)療機(jī)構(gòu)、疾控公衛(wèi)、高校科研等合作伙伴提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品與服務(wù)。
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